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ELISA试剂盒实验开始前注意事项试剂盒中的所有试剂均应按照说明书的说明保存。实验开始前，所有组分均应恢复至室温。为保证每种试剂的均匀性和准确性，使用前将所有组分混合均匀。整个实验过程中保持室温稳定。整个实验过程中pH值应保持在7.2-7.4之间。确保所有试剂都浓缩开始实验前适当稀释。整个实验过程中洗涤技术应保持一致，并按照手册中的说明进行。避免溶液中产生气泡，以确保所有反应的均匀性。添加终止液后 2 分钟读取微量滴定板的读数。标准品较差d 曲线

可能原因：

由于时间或储存不当导致标准品降解标准曲线稀释液制备不正确移液错误导致浓度不一致标准曲线数据绘制不当或未使用适当的软件无信号

可能原因：

试剂已过期 - 检查包装是否过期未添加检测试剂 A、B 或 TMB 底物用于稀释的蒸馏水被污染酶抑制剂（如叠氮化钠） ）存在洗涤缓冲液太浓且没有适当稀释标记酶被污染或失去活性溶液的pH值太高或太低。整个实验过程中所有溶液的 pH 值应保持在 7.2-7.4 信号弱

可能的原因：

试剂已过期或未在正确的条件下储存 - 检查包装上的过期日期试剂、标准品和/或样品在使用前未加热至室温进行实验时使用的试剂量和/或稀释度不正确使用的一种或多种溶液被污染标记的酶被污染或失去活性TMB底物未孵育足够长的时间洗涤程序问题，即：洗涤缓冲液太浓孔洗涤次数太多孔洗涤太剧烈每次孔洗涤时间太长无颜色梯度

可能原因：

TMB底物储存不正确（未放置在阴凉处并避光）孵育时间太长（可能会导致强烈的非特异性吸附）孔在一个或多个步骤中清洗不充分 移液器吸头或其他受污染试剂的交叉污染 包被抗体或检测抗体的浓度低或活化度低 重复数据差

可能的原因：

在一个或多个步骤中清洗孔不一致或不充分 试剂混合或制备不一致 一种或多种溶液被污染 溶液中形成气泡ellsAntibodiesWestern Blot：无条带或条带弱

可能原因：

孔中上样量不足，目标蛋白量过低或样品中不表达；考虑使用阳性对照样品 目标蛋白向膜转移不良 抗体浓度太低 抗体浓度太高 暴露时间不够 底物已失活，或孵育时间不够长 目标蛋白在转移过程中被降解或变性；考虑降低转移温度、减少电流或转移时间膜清洗问题；考虑减少洗涤的频率或持续时间使用的抗体无活性或浓度不够蛋白质印迹：高背景

可能的原因：

实验设备被污染膜材料导致背景封闭缓冲液与抗体发生干扰或交叉反应封闭步骤不够长抗体浓度过高膜洗涤问题s;确保无污染且洗涤步骤足够长曝光时间太长实验过程中出现其他污染Western Blot：非特异性条带

可能原因：

实验过程中蛋白样品被消化酶解孔中上样量过多封闭步骤不够长洗涤步骤不够长抗体浓度过高抗体特异性过低使用的目标蛋白存在多个剪接体或修饰位点Western Blot：其他实验问题s 膜上有黑点 – 封闭缓冲液不合适，可能与所用抗体非特异性结合 膜上有白色条带 – 目标蛋白或抗体浓度太高 分子量与预期不符 – 凝胶未正确混合，或浓度不正确 条带不均匀或迁移 – 设备工作不正常；样品溶解不彻底；电极不平衡；或者加载了太多样本Immunoh组织化学：样品未染色

可能原因：

程序中的一个或多个步骤未完成二抗与所使用的检测方法不兼容一抗和二抗不兼容目标蛋白在样品中未表达或表达不足抗体浓度不够高使用的一种或两种抗体已降解底物已降解所用缓冲液的 pH 值与实验不兼容

免疫组织化学：弱阳性染色< p>可能原因：抗原修复不良；建议使用热诱导表位修复和/或酶消化实验区域残留液体太多区域/切片在孵育过程中未安全水平未使用正确的固定方法免疫组织化学：非特异性染色

可能原因：

脱蜡时间不足存在内源酶/生物素封闭时间不够长使用的封闭缓冲液与抗体特异性不匹配ty 太低 洗涤步骤不够长 一抗或二抗浓度太高 DAB 孵育时间太长 石蜡或细胞已干燥 与内源蛋白和二抗发生不需要的交叉反应 由于使用的样品处理导致抗原易位 免疫荧光：弱或无荧光

可能原因：

样品中目标蛋白未表达或表达不足 抗原表位受到固定化影响细胞通透性差抗原由于细胞通透性而丢失；考虑降低渗透性试剂的浓度或时间使用的一抗或二抗浓度太低二抗选择不良免疫荧光：高背景荧光

可能原因：

一抗特异性不够一抗或二抗浓度太高封闭时间不足封闭缓冲液中发现IgG使用洗涤方案不充分细胞已干细胞因细胞而丢失抗原渗透性；考虑降低所用渗透试剂浓度或时间荧光显微镜未使用适当设置免疫荧光：快速荧光猝灭

可能原因：

使用的荧光素偶联二抗光稳定性差未使用防止猝灭的封闭剂免疫荧光：细胞自身荧光

可能原因：

固定细胞后，任何自发荧光均未淬灭 部分样品表现出自发荧光；考虑使用阴性对照并降低显微镜背景样品中存在的细胞成分表现出自发荧光样品中死细胞与活细胞的数量过高流式细胞术：荧光弱或无荧光

可能的原因：

所用抗体的储存或处理不当在实验之前抗体荧光被淬灭所使用的细胞表现出与所用抗体相似的高自发荧光Inef有效的染色时间或温度细胞内蛋白染色的程序不当尝试检测细胞外分泌蛋白目标蛋白在所用样品中表达量非常低；考虑使用更亮的染料以获得更好的检测抗原已因样品制备或储存而受损流式细胞仪激光功能不正常；检查校准数据收集时使用的过滤器不合适数据过度补偿使用的细胞门不合适数据分析不良流式细胞术：高背景荧光

可能的原因：

使用的细胞表现出高自发荧光使用的抗体已与死细胞结合；考虑使用活性染料Cy5等蓝色染料使用不当抗体浓度过高细胞染色时间过长洗涤程序不充分实验补偿调节不足流式细胞术：荧光异常

可能原因：

使用的同型对照浓度不正确同型对照匹配不良包括粘附或死细胞实验条件影响细胞特征分子双（柱/试剂）试剂盒：DNA 分离

问题：DNA 产量低

可能原因：样品裂解不完全可能原因：使用前未将无水乙醇添加到缓冲液 W2 可能原因：添加到柱之前未将乙醇添加到裂解液中可能原因：缓冲液 E 的 pH 值太低，或缓冲液 E 尚未预热可能的原因：起始材料质量差或样品储存不当

问题：DNA 已降解

可能的原因：样品不新鲜或储存不当，或经过冻融循环可能的原因：DNase 污染

问题：抑制下游酶反应

可能的原因：纯化的 DNA 含有残留的乙醇可能的原因：纯化的 DNA 含有残留的盐柱套件：DNA 分离

问题： DNA 产量低

可能的原因：裂解不完全可能的原因：缓冲液 W2 b 中未添加乙醇使用前 可能原因：洗脱条件不正确 可能原因：起始材料质量差或储存条件不当

问题：DNA 已降解

可能原因：样品不新鲜或经过反复冷冻/解冻循环 可能原因：DNase 污染 可能原因：过度移液或均质化损坏了 DNA

问题：RNA 污染

可能原因：RNA 去除不完全（使用 RNase）处理）

问题：抑制下游酶反应

可能原因：纯化的 DNA 含有残留乙醇柱套件：PCR 产品的 DNA 分离

问题：DNA 产量低

可能原因：使用前未将乙醇添加到缓冲液 W2 可能原因：核酸酶污染可能原因：柱超载；减少上样量或起始样品量可能原因：凝胶尚未完全溶解；增加凝胶提取时间 可能的原因：洗脱条件不正确 可能的原因：使用的洗脱缓冲液的体积太小

问题：抑制下游酶反应

可能原因：用于洗脱 DNA 的缓冲液不正确可能原因：纯化的质粒含有残留乙醇

问题：DNA 在流出液或洗涤组分中通过

可能原因：柱超载；减少上样量或起始样品量 可能原因：所用缓冲液中的盐或 pH 条件不合适

问题：在琼脂糖凝胶中运行时，纯化的 DNA 从孔中浮出

可能原因：在洗脱产品之前，未从柱中完全除去痕量乙醇色谱柱套件：RNA 分离

问题：RNA 产量低

可能原因：裂解或匀浆不完全可能原因：洗脱条件不正确

问题m：完整性低或 RNA 降解

可能原因：RNase 污染

问题：下游酶反应受到抑制

可能原因：纯化的 RNA 含有残留乙醇柱试剂盒：病毒核酸分离

问题：产量低

可能原因：裂解不完全可能原因：洗脱步骤中存在之前步骤的残留缓冲液可能原因：病毒核酸粘在柱上（重复洗脱步骤并在离心前用水孵育柱 5 分钟）

问题：RNA 降解

可能原因：起始材料质量差或储存不当可能原因：RNase 污染

下游应用中 RNA 性能不佳

可能原因：纯化产品含有残留乙醇磁珠试剂盒：DNA 分离

问题：DNA 被剪切或降解

可能原因：裂解液用移液器混合得太剧烈可能原因：DNase 污染可能原因：洗脱/释放步骤中存在水 (pH>7)

问题：RNA 污染

可能原因：RNA 去除不完全（使用 RNase 处理）

问题：DNA 产量低

Po可能原因：裂解和/或匀浆不完全可能原因：磁珠制备不正确（涡旋管并在使用前完全重悬磁珠）se) 可能原因： 蛋白质污染（使用蛋白酶 K 处理） 可能原因： 洗脱/释放条件不正确 可能原因： 起始材料质量差或储存不当

问题： UV 测量背景高

可能原因： 纯化产品中存在残留珠子（必要时重复磁力分离） 质粒试剂盒： 质粒分离

问题： RNA 污染

可能原因： RNA 去除不完全（使用 RNase 处理）

问题：琼脂糖凝胶上出现质粒条带拖尾

可能原因：质粒 DNA 降解（将制剂置于冰上或冷冻）

问题：质粒质量差

可能原因：基因组 DNA 污染；细菌培养物不要过度生长

问题：DNA 产量低

可能的原因：质粒拷贝数低可能的原因：使用前未将乙醇添加到缓冲液 W2 可能的原因：核酸酶污染可能的原因：色谱柱超载可能的原因：缓冲液 S2/M2 中的 SDS 在储存中沉淀（要解决，请在 30-40oC 并充分混合）可能原因：洗脱条件不正确可能原因：大肠杆菌中质粒丢失。大肠杆菌宿主

问题：抑制下游酶反应

可能原因：用于洗脱 DNA 的缓冲液不正确可能原因：纯化的质粒含有残留乙醇

问题：DNA 在流通液或洗涤组分中通过

可能原因：柱超载；减少上样量或起始样品量 可能原因：使用的缓冲液中的盐或 pH 条件不合适

问题：在琼脂糖凝胶中运行时，质粒 DNA 从孔中浮出

可能原因：在洗脱产品之前未从柱中完全除去痕量乙醇试剂盒：DNA 分离

问题：难以溶解 DNA

可能原因：乙醇去除不完全可能原因：沉淀过度干燥< p>问题：RNA 污染可能原因：RNA 去除不完全（使用 RNase 处理）

问题：DNA 产量低

可能原因：裂解和/或均质化不完全建议：彻底研磨组织样本，并确保根据起始材料的量使用适当的方法来制备裂解物。将组织样品切成小块并确保组织完全浸入裂解缓冲液中可能原因：存在乙醇可能原因：在间相澄清之前未重复分离阶段可能原因：沉淀条件不正确或沉淀时间太短

问题：DNA 已降解

可能原因：使用的样品不新鲜或储存不当可能原因：DNase 污染

问题：抑制下游酶反应

可能原因：纯化 DNA 中存在乙醇

问题：A260/280 比率低于 ~1.7

可能原因：蛋白质或其他污染物去除不完全试剂盒：RNA 分离

问题：RNA 难以溶解

可能原因：所有乙醇去除不完全

问题：基因组 DNA 污染

可能原因：不完整去除 gDNA（使用 DNase 处理）

问题：RNA 降解或完整性低

可能原因：RNase 污染（考虑 RNase 抑制剂）

问题：RNA 产量低

可能原因：裂解和/或均质化不完全建议：彻底研磨组织样本，并确保根据起始材料的量使用适当的方法制备裂解液。将组织样品切成小块，并确保组织完全浸入裂解缓冲液中可能的原因：沉淀条件不正确可能的原因：起始材料质量或储存不良

问题：抑制下游酶反应

可能的原因：纯化的 RNA 中存在乙醇不要错过更新。

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